第一章 眼科相關基礎知識 / 第二節 角膜病理 三、PRK及LASIK後的角膜修復
三、PRK及LASIK後的角膜修復
角膜創傷修復(corneal wound healing)是一個複雜的過程，通常包括：細胞的激活、增殖、分化、細胞因子的釋放，細胞外基質的合成與重構等。創傷修復過程是由多種細胞因子(cytokines)在時間和空間上的高度協調而完成的，這一過程直接影響創傷修復的質量。創傷修復反應的差異性已日益成為一種影響各種屈光性角膜手術手術後穩定性和可預測性的重要決定因素。
近年來，人們在研究和控制角膜創傷修復過程方面進行了相當大的努力，儘管調控角膜創傷修復可能會改善屈光性角膜手術的效果，但是許多修復過程機制尚待進一步研究。
(一) PRK後的修復
角膜創傷修復過程直接影響著屈光性角膜手術的穩定性和可預測性，與皮膚創傷修復類似，角膜的創傷修復過程涉及到複雜的細胞反應和生化反應過程，最終達到組織完整性的重現。
1.修復類型(type) PRK後修復依據不同時間可分為急性(早期)修復和慢性(晚期)重塑兩個階段。依據修復部位分為角膜上皮修復和角膜基質修復。
在手術後不同階段，組織修復反應有一定差異，但臨床上並沒有明顯的界限。組織間反應是相互聯繫的。
2.修復過程(course)
急性修復期
指PRK後1週內角膜組織對手術創傷的反應。急性期的角膜反應為上皮基底膜和前彈力層的缺損，激活角膜上皮和基質細胞增生、移行、巨噬細胞清理損傷的組織，細胞外基質合成，纖維蛋白原沈積，基質膠原不連續排列等。
慢性重塑期
是指急性期後的角膜組織對手術損傷的反應。此期主要組織反應為角膜上皮的過度增生，角膜前基質內出現激活的成纖維細胞，上皮下出現以Ⅶ型膠原為主的新膠原，角膜上皮和基質交界面下霧狀混濁出現，上皮細胞有向角膜中央移動的傾向，角膜瘢痕形成，成熟。
角膜下霧狀混濁(haze)是指屈光性角膜手術後切削區出現的上皮和基質交界面下的混濁。發生機理目前尚無定論，激活的角膜基質成纖維細胞及分泌過多的紊亂排列的以Ⅶ型膠原為主的膠原，是上皮下霧狀混濁的重要原因。屈光回退(regression)則與激活的成纖維細胞過度增生及合成的細胞骨架、粘附分子及細胞纖維連接素等所致的瘢痕收縮有一定關係。
由此可見，上皮下霧狀混濁和屈光回退與基質成纖維細胞的激活增殖、過度合成分泌有密切關係。
角膜上皮細胞的修復
正常角膜上皮細胞是處於不斷的自我更新狀態，表層細胞的脫離和基底細胞的增殖、分化構成動態平衡。Ren等揭示正常角膜表層上皮主要由有活性的細胞構成，經典型的、有限水平的細胞凋亡(apoptosis)而脫離；而少數為無活性細胞，由終末分化而脫落。PRK後全層上皮均顯示凋亡。
上皮的修復過程是生理性死亡形式的細胞凋亡與細胞增殖相互平衡的結果，以維持細胞正常的生理功能和數量穩定，在發育分化、細胞修復等穩態中發揮重要作用。這一過程涉及到多種細胞和眾多細胞因子的時空上的協調。實驗證明，PRK後上皮細胞凋亡及損傷的數目直接影響以後的癒合過程。此外，上皮的損傷也可通過上皮－基質細胞間相互作用，而影響角膜基質細胞的修復。
PRK後3天內，上皮即覆蓋切削面。共聚焦顯微鏡活體觀察PRK後上皮創傷修復，可見上皮結構完整，上皮下發光增強，早期上皮厚度增加，以後逐漸恢復正常。
角膜基質細胞的修復
大量實驗研究及臨床觀察證明，角膜上皮創傷後，立即出現了前基質細胞的消失。電鏡、電泳及TdT介導dUTP缺口末端描記等方法，均顯示這種上皮損傷後前基質細胞是由細胞凋亡所介導的。其反應主要是細胞內發生一系列信號傳遞反應。
角膜前基質細胞的凋亡存在著動態變化的過程：4小時後達到高峰，其後逐漸下降，可延續至10天以後。同時，鄰近的基質成纖維細胞被激活、增殖，並在損傷後3天內重新分佈於前基質，這些新生的基質細胞具有粗大的內質網，以及激活的成纖維細胞形態。
由此可見，早期上皮損傷後的基質細胞凋亡可能是PRK等屈光性角膜手術後修復反應的激活因素。隨後的角膜傷口癒合來源於健存基質中被激活的成纖維細胞，具有成肌纖維細胞(myofibroblast)的特徵，合成細胞骨架成分，粘附分子、細胞纖維連接素和各種膠原等細胞-外基質，在創傷修復及瘢痕收縮中起著重要作用。
3.角膜細胞與胞外基質間的相互作用 細胞與其環境胞外基質(ECM)的相互作用，在細胞行為和組織構建的調節中起著重要的作用。在高度調控的角膜創傷修復過程中，細胞凋亡與細胞增殖分化，是角膜上皮－基質細胞－胞外基質相互作用的結果，涉及到多種信號的參與。而作為細胞間信號傳遞的細胞因子，則提供了上皮與基質間相互作用的基礎。在多種情況下，細胞與特定基質的特異性作用，有助於穩定或保持表現型或特殊的組織結構。在組織的重建中，這種作用是不穩定的，並不斷發生變化。角膜細胞與細胞外基質相互作用的多樣性是一系列細胞因子表達、ECM組成、ECM分子合成和降解的平衡及受體轉錄調節的共同作用的結果。
(1)上皮和基質成纖維細胞間的細胞因數表達
上皮廣泛表達而受體在成纖維細胞上，如TGF-α、IL-1、PDGF-β；
上皮和成纖維細胞既表達細胞因子又表達受體，如IGF-1、TGF-β1，2、LIF、bFGF；
成纖維細胞廣泛表達而受體在上皮細胞，如KGF、HGF；
上皮和成纖維細胞均表達而受體在其他細胞，如MCSF、IL-8
細胞因數介導著細胞與基質間的相互作用，參與角膜上皮的生長與分化。在創傷修復中，由於基底膜的破壞，激活的上皮細胞與基質細胞所分泌的細胞因數相互協調，決定著相互的增殖與凋亡。
(2)屈光性角膜手術與修復反應 屈光性角膜手術對上皮－基質細胞－胞外基質間促凋亡信號傳遞有不同的影響，存在著不同的創傷修復反應。
Helena等定性定量比較了PRK與LASIK對修復的影響，PRK細胞凋亡反應限於前基質，而LASIK後基質細胞反應在深基質板層切口前後。由於創傷時，角膜上皮分泌的多種細胞因子可通過胞外基質作用通路，刺激基質細胞表達；基質細胞表達又可使一些細胞因子通過胞外基質間的特殊因子的作用，刺激上皮的過度增生。細胞凋亡對以後的修復起著重要影響。細胞凋亡越多，以後的增殖反應越明顯。這對屈光回退的研究有著重要意義。
4.共聚焦顯微鏡活體觀察PRK後創傷修復 正常角膜表層上皮細胞有反光細胞核，基質細胞排列整齊，細胞核反光弱，前基質較後基質細胞數略多，形態略不規則，內皮細胞為均勻的高反光六角形細胞。PRK後角膜細胞結構變化如下：
(1)角膜細胞數目、形態的變化 PRK後不同時間角膜細胞數目、形態變化主要顯示在前基質層。未見後基質及內皮細胞變化。個體間差異較大。手術後早期前基質細胞數目明顯減少，上皮－基質的光切削面存在強反光網狀結構(圖1-8)；10天、1個月細胞激活，數目增加，切削基質面反光最強(圖1-9)；3個月數目減少，基質細胞呈星形；6個月後激活的細胞群逐漸消失，細胞數目逐漸恢復正常。
圖1-8 PRK後早期基質反應
圖1-9 PRK後早期激活的基質細胞
PRK後可有瘢痕形成，主要表現細胞外基質光反射增強及大量激活的角膜細胞結構(如成纖維細胞)，具有不規則的排列、較多的隆起及伸長的細胞核(圖1-10)等特點。通過z軸位可測量瘢痕的厚度。
PRK後角膜的CMTF特點
①早期(4小時至1週)：表面上皮細胞形態學上未成熟，柔弱的神經、基質細胞明顯減少，
上皮－基質交界的光切削面存在強反光網狀結構，其下為低反光的空洞無細胞區。提示手術引起前基質細胞死亡。
隨後(10天)基質細胞激活、數目增加和細胞外反光瘢痕組織的沈澱物出現。PRK後激活的基質成纖維細胞群及其分泌的過多排列紊亂的以Ⅶ型膠原為主的膠原。
圖1-10 PRK後不規則膠質纖維
②後期(3個月)：被激活的前基質細胞逐漸的凋亡，使前基質細胞數目減少，並逐漸(6個月後)基本恢復正常。激活的角膜基質細胞所致的高反光(6、7個月)不再出現。同時可見到再生的上皮下神經索數量增加。如果激活的前基質細胞持續增生，則形成以多細胞成分為特徵的增生性疤痕，臨床上則表現為明顯的haze。
(2)角膜厚度 PRK後角膜各層厚度在不同的時間點是有變化的。手術前、後角膜各層厚度見表1-2。
PRK後1個月角膜全層、基質厚度均薄於手術前，而上皮明顯厚於手術前，以後逐漸恢復，角膜基質恢復較慢，提示角膜(特別是基質細胞)形態學上的變化存在。PRK時實際基質切削深度可以直接測量，由於組織壞死和損傷修復，手術後基質增厚可改善。
PRK後基質變薄。但臨床統計結果顯示，基質變薄和CMTF中haze估價或臨床haze級數間無顯著相關。
(二) LASIK後角膜修復
通過以上對PRK後角膜修復反應過程的瞭解，知道了屈光性角膜手術後角膜創傷的癒合反應是一個複雜的細胞和生化過程，最終達到組織完整性的重現。屈光性角膜手術的方式、手術創傷的面積、程度及個體差異直接影響著創傷修復的質量與術後的穩定。
LASIK後角膜上皮細胞層保持完整，所以基質的反應明顯較PRK後輕微。細胞反應主要表現在略深基質板層切口前後面。由於手術後角膜基質細胞凋亡極少，在組織的修復過程中細胞的激活、增殖、移行及細胞外基質的合成固然較弱。
共聚焦顯微鏡活體觀察LASIK後創傷修復
1.角膜細胞數目、形態變化
CMTF顯示手術後各時間點角膜細胞變化差異很小。1天、10天在前基質可見散在小點狀(<10μm)強反光的致密沉積物，1個月時消失。手術後1天、10天，前基質細胞較正常小，數目稍多；1個月、3個月、6個月各層細胞及胞質正常，術後1天，前、後基質及內皮細胞數(�mm2)分別為：996±73(1087∼732)、743±577(789∼548)、2610±113(2748∼2430)。同時未見到PRK後角膜未成熟的表面上皮細胞和纖細的神經、前基質細胞激活和細胞外高反光，以及瘢痕組織中沈澱物的出現。
角膜的CMTF特點：
角膜細胞及角膜厚度變化很小。
早期前基質細胞相對正常小，數目稍多；晚期各層細胞及胞質正常。
角膜表面上皮細胞正常。
2.角膜厚度 LASIK後1個月、6個月角膜厚度分別為558.3μm±71.4μm(697.2∼512.7μm)，549.8μm, 66.7μm(685.6∼503. 9μm)。
角膜創傷修復過程直接影響著屈光角膜手術的穩定性和可靠性，該過程涉及複雜的細胞和分子生物學相互作用，需經過一系列的特徵性的階段，即組織學、組織化學和生物化學的改變階段，通常包括細胞的激活、增殖、分化，細胞因子的釋放，細胞外基質的合成與重塑等。
觀察PRK及LASIK後角膜組織結構變化，為準分子雷射後的傷口癒合提供早期組織學資料，使醫生對術後動態的角膜結構演變進行分析，及時發現異常情況。
CMTF的臨床應用，為連續記錄活體角膜各個層面的變化提供了足夠的證據。從細胞學角度觀察角膜、上皮、基質；從組織學、組織生物學及病理學角度，觀察角膜細胞與細胞間的分子水平上的變化並對疾病提供診斷，這為進一步對準分子雷射角膜切削術後創面修復、基質細胞的激活、增殖及細胞外基質的合成、手術效果的評價研究提供了有利證據。
(李 瑩)